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为5×109个/L，将试管置于冰上，加5 μL的Annexin VFITC溶液和2.5 μL的碘化丙啶（propidium iodide, PI ）至100 μL的细胞悬液中，避光孵育10 min后，加入400 μL冰预冷的1×结合缓冲液，30 min内用流式细胞仪进行检测，分析各组细胞的凋亡情况.
统计学处理：采用SPSS11.0统计分析软件，细胞增殖实验中各处理组与对照组进行配对t检验，各实验组间进行F检验. P<0.05为差异具有统计学意义. 2结果
2.1siRNA转染后绿荧光蛋白的表达倒置显微镜明视野下，阴性对照组和阳性对照组细胞生长正常，形态无明显变化；倒置荧光显微镜暗视野下，阳性对照组的部分细胞胞内呈现绿色（图1）.
A,C: 转染含GFP基因的载体后MCF7和MDAMB453细胞表达绿荧光蛋白; B,D: 明视野下MCF7和MDAMB453细胞的生长形态.
图1倒置荧光显微镜下MCF7和MDAMB453细胞的绿荧光蛋白表达×400
2.2转染后细胞hTERT表达的变化以阴性对照组原始模板的相对浓度为标准，经 siRNAhTERT1，2和3转染后，hTERT mRNA的相对表达量，MCF7细胞分别为：35%，30%，31%；MDAMB453细胞分别为36%，33%，21%，siRNAhTERT1，2和3三个实验组间进行H检验，组间差异无统计学意义（P=0.368，P>0.05）. Western Blot检测结果显示，siRNAhTERT1，2和3三个实验组蛋白表达明显降低(P=0.00)，与阴性对照组相比较，三组间差异无统计学意义（P=0.223，P>0.05，图2）. 经siRNAhTERT1，
2，3和4处理后，hTERT蛋白条带灰度MCF7细胞分别为35%，25%，24%，76%；MDAMB453细胞分别29%，23%，29%，70%.
2.3转染后细胞增殖的变化48 h后siRNAhTERT1，2和3三个实验组和阴性对照组对MCF7细胞的抑制率分别为(57±4.3)%,（61±4.3）%,（65±6.0）%,（5.3±3.5）%；对MDAMB453细胞的抑制率分别为（45±5.1）%,（45±4.1）%,（50±4.0）%,(6.7±3.6)%. 配对t检验分析果显示，siRNAhTERT1，2和3三个实验组对MCF7细胞的生长抑制明显高于阴性对照组（P=0.023，0.016，0.028）；对MDAMB453细胞的生长抑制也明显高于阴性对照组（P=0.024，0.018，0.027），但三个实验组间的变化不明显（P=0.075, 0.085）.
2.4基因沉默对细胞凋亡的影响siRNAhTERT1，2和3转染MCF7和MDAMB453细胞48 h后，流式双标记检测结果显示，与阴性对照组相比较，Annexin 单染和AnnexinV/PI双染阳性细胞明显增加（F=124，P=0.00，图3）. 其中，siRNAhTERT1，2和3三个实验组Annexin 单染的细胞凋亡率MCF7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；MDAMB453细胞为(12.25±0.17)%,（17.80±0.19）%,（20.60±0.21）%.
3讨论
目前用针对疾病相关基因的siRNA进行基因治疗已取得了一定的进展，已有几种RNA技术新药进入临床实验，但尚未应用于肿瘤治疗. 有研究［9］发现hTERT基因在乳腺癌发生发展中起重要作用，目前有关抑制hTERT表达的研究多采用一种siRNA作用于某一种肿瘤细胞. 本实验设计三种靶向乳腺癌细胞株hTERT基因的siRNA，研究目的基因下调对细
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