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：5′dTdTCCUCGUCGACGCCGGGAGG3′；siRNAhTERT2正义链：5′AAGAGGGCCGAGCGUCUCAdTdT3′,反义链：5′dTdTUUCUCC CGGCUCGCAGAGU3′； siRNAhTERT3正义链：5′UGAUUUCUUGUUGGUGACAdTdT3′,反义链：5′dTdTACUAAAGAACAACCACUGU3′；siRNAhTERT4正义链：5′GGCCTAGCTGCGCGAGU3′,反义链：5′GGCCTCAGCTGCGCGACGA3′.
1.2.2siRNA转染转染前1 d，换取新鲜培养液后调整密度为2×108个/L，待细胞生长至60%～80%融合时，将siRNA脂质体混合物（100 μg/5 L）转染至细胞中，在37℃，50 mL/L CO2无血清、无抗素培养液培养16～1
8 h，换新鲜100 mL/L胎牛血清培养基，继续培养2～5 d后检测各指标. 实验分为空白对照组（不含转染试剂和siRNA）；阴性对照组（siRNAhTERT4处理）；阳性对照组（含GFP基因的载体处理）和三个实验组（siRNAhTERT1，siRNAhTERT2和siRNAhTERT3处理）.
1.2.3siRNAhTERT转染乳腺癌细胞株后hTERT表达变化的检测
1.2.3.1实时聚合酶链反应（realtime PCR）分别收集各组转染后48 h的细胞，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA. 取RT产物作为模板，进行realtime PCR，检测hTERT引物为：正义5′CCGTCTGCGTGAGGAGATC3′, 反义5′TCCGGTAGAAAAAGAGCCTGTT3′；hTERT Taqman探针：5′（FAM）GGCCAAGTTCCTGCACTGGCTGACT（TAMARA）3′；GAPDH引物：正义5′CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT3′，反义5′GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT3′；GAPDH Taqman探针：5′（FAM）AACAGCGACACCCACTCCTCCACC（Eclipse）3′. Realtime PCR反应体系为20 μL，包括：2×Premix EX TagTM缓冲液10 μL,10 μmol/L上下游引物各0.4 μL,探针0.8 μL, cDNA 2 μL,加双蒸水补足至20 μL. 反应条件：95℃ 10 s预变性后，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40个循环，每个样本设三个平行反应. GAPDH作为内参对照校正上样量. 以2(ΔΔCT) 方法计算hTERT mRNA的相对表达量.
1.2.3.2免疫印迹（Western Blot）检测分别收集转染48 h后的各组细胞，用预冷的PBS进行洗涤，加入蛋白裂解液进行裂解，提取总蛋白. 分别取50 μg蛋白，变性后经100 mL/L SDSPAGE分离，将凝胶置转移缓冲液中平衡15 min，再80 V 1.5 h湿转印蛋白到PVDF上， 100 mL/L FBS/TBST 4℃封闭过夜，加一抗，37℃震荡温育1 h, TBST漂洗3次，每次15 min，加HRP标记二抗，37℃震荡温育1 h, TBST漂洗3次，每次15 min. 取等量的ECL发光试剂A，B液混匀后孵育硝酸纤维素膜，压曝光，以βactin为内参.
1.2.4MTT法检测取对数生长期细胞，经2.5 g/L胰蛋白酶消化，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔3×103个细胞接种96孔培养板中，加入培养液200 μL，37℃，50 mL/L CO2培养箱培养. 次日进行瞬时转染，分别在转染后24,48,72,96 h进行检测. 检测时每孔中加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，到达检测点时弃去培养液，再加入DMSO 200 μL，震荡10 min，于自动酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度（A）值. 按照公式计算细胞生长抑制率. 抑制率(%)=［(对照组A492 nm-实验组A492 nm) /对照组A492 nm］×100%.
1.2.5细胞调亡的流式细胞术检测收集转染后48 h各组细胞，预冷PBS洗涤2次，用预冷的1×结合缓冲液重悬细胞，调整终密度 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页 |
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