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EMB基因330密码子分子DNA探针设计及荧光检测 |
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| EMB基因330密码子分子DNA探针设计及荧光检测 |
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(EMB)emb基因包含330密码子突变位点的序列设计分子DNA探针。登陆GenBank，找到结核杆菌耐乙胺丁醇(EMB) emb基因包含330密码子突变位点序列，在Primer Premier V5.0 软件上设计结核合杆菌特异性引物，经NCBI BLAST 比对验证。分子DNA探针设计软件采用Beacon designer软件。引物embB306codon Primer1：5′AGCTGGCGCACCTTCACCCT3′，引物embB306codon Primer2：5′TGGCAGGCGCATCCACAGA 3′，分子DNA探针TBembB330codonMB：5′FAMAGTCCAGTGGAGGATCCCTTCGGCTGGACTGGACTDABCYL3′。引物及探针均由上海生工生物科技有限公司合成。
1.4 结核杆菌embB330codon序列PCR扩增
PCR缓冲液5 μL、dNTP(0.4 mmol/L) 0.5 μL、MgCl210 μL、引物embB330 codon Primer1 (2 OD/40 μL) 0.5 μL、引物embB330 codon Primer2 (2 OD/40 μL) 0.5 μL、模板（含H37RV或耐EMB菌株42RE＼A021E＼307E等，100 mmol/L) 2 μL、ddH2O 29.5 μL、TBembB330codonMB(100 mmol/L) 1 μL、TaqE 1 μL，上述组份混合液建立50 μL的反应体系。TB分子DNA探针PCR扩增条件为：在热循环仪上94 ℃预变性5 min后，按94 ℃30 s，65 ℃ 1 min和72 ℃1 min运行35个循环，94 ℃变性30 s后，72 ℃退火1 min结束。
1.5 荧光分光光度计的液相观测
实验步骤：荧光分光光度仪的石英比色器最低体积要求为1 mL，标本作稀释：25 μL MBPCR标本+975 μL无菌三蒸水。打开荧光分光光度计，进入操作界面。选择激发波长494 nm，发射波长 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一页 |
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