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EMB基因330密码子分子DNA探针设计及荧光检测 |
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| EMB基因330密码子分子DNA探针设计及荧光检测 |
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B第306位甲硫氨酸密码子突变为缬氨酸最常见，此外，尚有285、303、330等密码子单碱基突变现象，较为复杂多样［3］。传统检测方法如培养法需时较长，且不能准确测定EMB耐药基因。随着分子生物学技术的发展，使用分子探针（如分子信标）准确靶向检测DNA突变位点，成为一种新的高灵敏检测技术［2］。
STRAIN1、2：TB标准菌株H37RV的embB330密码子正/反向序列(来自GenBank)；305SRE 1、2：TB临床分离株305SRE的embBPCR 扩增产物正/反向序列；1-20：上、下游引物段；（圈所示为330密码子突变点）
图3 突变株305SRE embB扩增产物正/反向测序与标准菌株比对结果（DNAsis软件分析）
本研究针对耐乙胺丁醇位点embB330密码子设计分子DNA探针，随着扩增进程，实现边扩增、分子DNA探针与靶DNA边杂交，运用荧光分光光度计直接观测液相中杂交产物的荧光信号，达到准确检测embB330密码子靶点的目的。空白对照组由于没有荧光素分子，所以荧光背境很低；金葡菌对照组没有相应模板及靶序列，与分子DNA探针无法结合，茎环不能打开，荧光强度也很低，但有一定荧光背景。305SRE 330密码子突变株由于点突变TTC→GTC，与分子DNA探针不能结合，茎环未打开，荧光强度较低，但由于有荧光素分子的存在，故有一定荧光背景；embB330密码子无突变组与分子DNA探针完全结合，茎环打开，荧光强度高，但有个别为靶环其他位点突变，平均值与H37RV标准菌株略有不同；H37RV标准菌株没有点突变，与分子DNA探针完全结合，茎环打开，荧光强度最高；对照测序结果，两者的突变检出率为3%，说明本地区embB330密码子点突变占结核杆菌耐乙胺丁醇基因突变的比例较低。通过荧光分光光度计［45］直接观测液相中的分子DNA探针与靶点杂交荧光，快速鉴定部分结核杆菌耐EMB基因点突变，具有无须分离纯化、简单、耗时短、高效、准确等优特点。
【参考文献】
［1］ Ahmad S, Mokaddas E, Jaber A 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一页 |
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