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FLS的分离、 鉴定、 培养 无菌获取关节镜术切除的RA患者滑膜组织, 尽量剔除脂肪及纤维组织, 无菌PBS冲洗2～3遍, 反复剪切成细小组织块, 置于无菌培养皿中, 加入2 g/L的胶原酶Ⅲ 37℃消化24 h, 200目纱网过滤后, 离心, 去除脂肪及杂质, 加入含100 mL/L小牛血清(含青霉素、 链霉素)的DMEM, 分装于培养瓶内, 置于37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养24 h后, 更换培养液, 待滑膜细胞80％汇合成片, 按1∶3的比例消化传代, 实验用3～7代细胞。FLS的鉴定采用流式细胞术测定CD14、 CD68, 免疫组化法测定vimentin蛋白。CD14、 CD68均阴性, vimentin蛋白免疫组化染色呈阳性, 证实所分离的细胞为成纤维样滑膜细胞。
1.2.2 细胞因子刺激实验 取处于对数生长期的FLS, 经2.5 g/L胰蛋白酶消化后, 反复吹吸成单细胞悬液, 调整细胞密度为2×108 cell/L, 接种于6孔细胞培养板, 37℃贴壁培养24 h后, 弃掉培养液, 用10 mL/L FCSDMEM培养液同步化培养24 h后, 分别加入TWEAK（0、 1、 5、 50、 100 μg/L）各3孔, 其中2孔分别加入TNFα(1 μg/L）或IL1β(0.1 μg/L）, 37℃ 50 mL/L CO2孵箱内持续培养72 h后, 收集细胞培养液和细胞, 并向收集的细胞中加入1 mL TRIzol, 置-20℃备用。
1.2.3 MMP3浓度检测 采用双抗夹心ELISA法检测细胞培养液中MMP3的浓度, 按试剂盒提供的说明操作。试剂盒既可测 proMMP3, 又可测活化状态的MMP3。以所测标准品A值作为纵坐标, 标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线。根据细胞培养液样品的A值在标准曲线上查出其浓度。
1.2.4 RNA的提取 取加入TRIzol 1 mL冻存的FLS, 经0.2 mL氯仿处理后离心, 上清用异丙醇沉淀, 750 mL/L乙醇洗涤沉淀物, 弃乙醇, 室温干燥后将沉淀溶于适量DEPC水中, 核酸紫外分析仪检测, 计算RNA纯度与 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 下一页 |
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