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浓度, -70℃冰箱保存。
1.2.5 反转录聚合酶链反应（RTPCR） cDNA合成采用反转录试剂盒, 总体积为10 μL: RNA模板1 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, 10×RT Buffer 1 μL, 10 mmol/L dNTP 1 μL, 反转录酶 0.5 μL, RNase Inhibitor 0.25 μL, Random 9 mers 0.5 μL, RNase Free dH2O 3.75 μL。反应条件: 30℃ 10 min, 42℃ 30 min, 99℃ 5 min, 5℃ 5 min。-20℃ 冰箱冻存以备PCR用。
1.2.6 PCR扩增 MMP3引物（上游） 5′ATGAAGAGTCTTCCAATCCTACTGT3′, （下游）5′CATTATATCAGCCTCTCCTTCATAC3′, 扩增产物488 bp; βactin引物（上游） 5′AAATCGTGCGTGACATTAA3′, （下游）5′CTCGTCATACTCCTGCTTG3′, 扩增产物472 bp。反应总体积为50 μL , 其中5×PCR Buffer 10 μL, 10 mmol/L上游及下游引物1 μL, Taq DNA 聚合酶0.25 μL, cDNA模板10 μL, 加双蒸水至总体积50 μL。退火温度为58℃。
1.2.7 PCR反应产物分析 取10 μL扩增产物在含0.5 mmol/L溴化乙啶的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶自动成像分析系统扫描成像, 以电泳条带的密度值作为条带的强度指标, 目的基因与内参照的条带密度比值表示mRNA的相对表达量, 对表达产物进行半定量分析。
1.2.8 统计学分析 检测的数据输入SPSS10.0分析软件, 计量资料用x±s表示, 多样本均数比较采用单因素方差分析, 两两比较采用t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果
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