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钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位 |
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| 钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位 |
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upo 等［8］和林筱洁等［9］选用操作简便、 容易制备的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为载体分别成功地制备了小鼠抗细菌脂多糖和抗人细胞色素P4501A1的血清。但他们通常在切胶前, 用锌离子或铜离子对凝胶进行染色, 切胶后再用鳌合剂去除凝胶中的金属离子。与之相比, 本实验使用氯化钾对凝胶进行短暂染色, 直接从聚丙烯胺胺凝胶上切割下含有CIB的凝胶条带, 切下的凝胶块无需去除氯化钾, 切碎后作为抗原可直接免疫小鼠制备CIB抗血清, 进一步简化了免疫原的制备过程。
直接使用未经纯化的抗血清会出现较高的非特异性背景, 因此要想得到更理想的实验结果, 就需要对抗血清进行纯化。本实验用Protein G、 抗原亲和层析柱进行纯化。在抗体纯化过程中, 由于洗脱条件的选择, 有时会造成抗体的失活, 所以纯化后的抗体活性以及特异性是评价抗体的重要指标, 我们使用纯化后的多克隆抗体进行了细胞内源性CIB的Western blot检测, 发现仅在22 000 bp处有特异性的条带, 说明通过该方法制备的多克隆抗体有较好的特异性, 可以用于进一步的功能研究。
此外, CIB的亚细胞定位也有很大差别［7, 10］。Ma等［5］的研究则发现绿色荧光蛋白GFP标记的CIB在COS7细胞中主要定位于细胞核, 细胞质中只有少量表达。Zhu等［11］的研究发现无表位标记或myc标记的C IB在HeLa细胞中过表达, 无表位标记的CIB在细胞核及细胞质中有较强的荧光, 与内源性CIB的表达模式相似; 而cmyc标记的C IB在细胞质(尤其是内质网)及细胞膜上有较强的表达, 而核内的表达较弱。我们利用免疫荧光技术观察了CIB在人脑胶质瘤细胞株SHG44及肝癌细胞株Huh7中的定位, 结果显示CIB蛋白在两种细胞中主要表达于细胞质中, 尤其在核周表达密集, 同时细胞核中也有少量表达。Blazejczyk等［12］的研究也发现CIB在大鼠前脑及小脑的神经元中也主要在细胞质中表达, 这与我们的研究结果相似。由于CIB可与多种蛋白结合, 参与多种生理或病
［4］ Bernstein HG, Blazejczyk M, Rudka T, et al. The Alzheimer disea上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 下一页 |
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