小鼠Lyn抗体、 兔抗小鼠PLCγ2抗体和HRPpTyr小鼠单克隆抗体(mAb)购自加拿大SantaCruz公司。
1.2 实验动物处理与分组 34只近交系无特定病原体(SPF)级6~8周健康雄性C57BL/6J小鼠, 质量20~24 g; 15只SPF级4~6周健康雄性C57BL/6J小鼠, 质量18~22 g, 由中南大学实验动物中心从上海斯莱克斯实验动物有限公司购入。应用SPSS13.0随机数字表, 将34只6~8周C57BL/6J小鼠分为3组: 模型组(A组): 实验0 d、 30 d、 60 d连续3次以TAChR抗原乳剂200 μL(20 μg TAChR、 100 μL CFA、 100 μL PBS)皮下注射小鼠的双肩及后足垫, 每个部位50 μL免疫动物, 诱导EAMG发作; 干预组(B组): 实验0 d、 30 d、 60 d连续3次以TAChR抗原乳剂免疫动物, 3 d、 33 d、 63 d分别以负载Tα146~162(50 mg/L)的iMDCs干预; 对照组(C组): 实验0 d、 30 d、 60 d连续3次予CFA+PBS皮下注射, 3 d、 33 d、 63 d予1 mL PBS皮下注射。按Berman等[3]评分标准做EAMG严重性的临床评估, 评分1分以上者进行发病率的计算。15只4~6周C57BL/6J小鼠用途为取DCs, 不参与分组。
1.3 DC的培养 参照胡珏等[2]方法提取骨髓并诱导DC分化。DC表型分析: 收集培养的DC, 用PBS重新将细胞制成悬浮液并调整细胞密度为1×109/L, 台盼蓝染色细胞活力>95%, 加入试管, 分别加入荧光抗体标记抗体CD11C、 CD40、 CD86和MHCII, 4℃孵育30 min, PBS洗涤2次, 以荧光标记的同型Ig作对照, 流式细胞仪(FACS caliber, BD公司)检测, CellQuest软件分析。
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