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免疫干预实验性自身免疫性重症肌无力小鼠的B细胞活化机制 |
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| 免疫干预实验性自身免疫性重症肌无力小鼠的B细胞活化机制 |
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1.4 Western blot检测Lyn、 Btk、 PLcγ2、 Syk蛋白表达及蛋白磷酸化表达 小鼠在第90天以断颈法处死, 夹取小鼠腹股沟、 腘窝、 腋下淋巴结及脾脏。胞质裂解液提取蛋白。BCA方法测定蛋白浓度后-70℃保存。50 μg蛋白变性后选用100 g/L SDSPAGE胶分离电泳, 150 mA恒湿法电转移1.5～2 h至硝酸纤维素膜（NC膜）。取出NC膜丽春红染色至看到清楚的条带, 双蒸水洗去丽春红。30 g/L BSA＋50 g/L脱脂奶粉37℃摇床封闭1 h。兔抗小鼠Btk抗体、 兔抗小鼠Syk抗体、 兔抗小鼠Lyn抗体、 兔抗小鼠Btk抗体、 兔抗小鼠PLCγ2抗体和HRPpTyr小鼠mAb, 30 g/L BSA＋50 g/L脱脂奶粉封闭液稀释（1∶500）, 4℃摇床过夜。TBS室温下漂洗3次, 每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗（1∶2 000）, 室温下作用1～1.5 h。TBS室温下漂洗3次, 每次10 min。把ECL液均匀加在膜上显色5 min, 吸干ECL液, 暗室中曝光显影、 定影。已加入HRPpTyr小鼠 mAb的NC膜不需再加二抗, 可直接显色。GIS凝胶图像处理系统 V3.74进行胶片分析, 用βactin（1∶2 000）作为内参照蛋白, 实验方法和操作步骤均与目的蛋白相同。目的蛋白光密度与βactin光密度比值即为目的蛋白的相对值。
1.5 统计学分析 结果用x±s表示, SPSS13.0 软件包分析。成组设计的多样本间均数的比较用方差分析, 两样本均数的比较用t检验, 多样本均数间每两个样本的比较用q检验。半定量评分两样本间比较用MannWhitney U检验。
2 结果
2.1 DC形态学特征及表型 培养24 h后, 倒置相差显微镜下可见贴壁的单核细胞聚集成团并均匀分布, 细胞呈小 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] ... 下一页 >> |
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