|
07/L密度接种于用 96 孔培养板中, 每孔100 μL, 37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养至细胞贴壁, 加入A77 1726, 使之终浓度分别为0 μmol/L、 25 μmol/L、 50 μmol/L、 75 μmol/L、 100 μmol/L, 每一浓度重复5孔, 37℃、 5 mL/L CO2孵箱中培养 20 h , 每孔加入 MTT 20 μL, 继续培养4 h, 吸弃培养基, 用无血清培养液洗 1 次, 加150 μL二甲基亚枫溶解沉淀, 振荡10 min, 结晶物溶解。比色: 选择570 nm波长, 在酶联免疫检测仪上, 以空白孔调零, 测定各孔光吸收值。以空白未加药物组作为对照组, 其余各组抑制率=(1-实验组A)/对照组A×100%。
1.2.2 羟脯氨酸释放试验观察A77 1726对IL13促进成纤维细胞分泌胶原的影响 成纤维细胞以5×108/L接种于培养瓶, 细胞汇合达80%左右时, 无血清DMEM培养12～16 h, 实验对照组加IL13（100 μg/L）单独作用24、 48、 72 h, 实验组为IL13（100 μg/L）和A77 1726（50 μmol/L）共同作用成纤维细胞24、 48、 72 h, 细胞培养上清液进行羟脯氨酸释放实验, 比较各实验组和实验对照组羟脯氨酸含量的差别, 按试剂盒说明操作。
1.2.3 RTPCR检测A77 1726对IL13促成纤维细胞I型胶原α1 mRNA表达的影响 取对数生长期细胞, 无血清DMEM培养12～16 h, 实验分组同1.2.2, 用SV total RNA isolation system提取总RNA, 逆转录合成第1条cDNA, 使用COL1A1特异性引物, 按照TKR RTPCR kit标准程序进行扩增, 产物为378 bp, 进行10 g/L琼脂糖电泳。
1.2.4 Western blot检测A77 1726对IL13促成纤维细胞I型胶原蛋白表达的影响 取生长良好的成纤维细胞, 细胞密度5×108～1×109/L接种于培养瓶中, 无血清培养12～ 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] 下一页 |
用户登录 
新用户注册 