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人大肠癌抗原基因 cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定 |
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| 人大肠癌抗原基因 cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定 |
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cDNA噬菌体表达文库。
1 材料和方法
1.1 材料 CCL187和CX1人大肠癌细胞株由美国哈佛大学医学院肿瘤所惠赠。TRIzol试剂购自美国Invitrogen 公司; DMEM培养基购自Gibco公司; mRNA分离纯化试剂盒购自德国Qiagen公司; ZAP Express cDNA Synthesis Kit和ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 购自美国Stratagene 公司。LB 培养基胰蛋白冻、 酵母提取物购自 Oxoid LTD; 盐酸四环素购自 Amresco 公司; 异丙基硫代βD半乳糖苷 (IPTG) 、 5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷( Xgal)为TaKaRa公司产品。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取和纯化 培养人大肠癌细胞CCL187和CX1至对数生长期, 倒去培养液, 用PBS冲洗后加入TRIzol试剂, 裂解细胞并抽提总RNA, 用Qiagen的mRNA分离纯化试剂盒分离纯化mRNA, 用紫外分光光度计测定其A260/A280比值及含量, 用MOPS甲醛变性凝胶电泳观察完整性。
1.2.2 cDNA 合成 按Stratagene公司试剂盒说明书进行。取5 μg 纯化的mRNA样品作为模板, 用50个碱基的寡聚核苷酸为合成引物, 序列为5′GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA ACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′（下划线处为Xho I 酶切位点）, 加逆转录酶StrataScriptRT（MMLV）, 混匀后42℃水浴1 h, 逆转录合成 cDNA第1链。置换法用RNaseH将mRNA降解成小片段作为引物合成 cDNA 第2链。合成的 cDNA第1链取5 μL, 第2链取1 μL用于电泳观察片段大小。双链合成后经 Pfu DNA聚合酶将链末端补平, 末端补平的cDNA上下游与EcoRⅠ适配子接头连接, 再将EcoRⅠ适配子的5′末端磷酸化, 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 下一页 |
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