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用XhoⅠ酶切消化, 生成的cDNA分子一端带有Xho I黏性末端, 另一端带有EcoR I黏性末端。此cDNA产物经Sepharose CL2B层析柱按分子大小分离并分部收集, 共收集15管, 分别合并第6、 7、 8管和第9、 10、 11管, 合并后的两管各取8 μL经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳观察cDNA 产物片段大小。收集大于400 bp的片段并混匀, 乙醇共沉淀后溶于3.5 μL去离子水中, 取2.5 μL (100 ng) 的cDNA在T4 DNA连接酶的作用下与1 μg的ZAP Express载体进行连接, 载体预先用EcoRⅠ和XhoⅠ处理过。按Stratagene 公司包装试剂盒说明进行包装反应: 从-80℃取出包装蛋白, 融化后加入连接产物, 22℃水浴 2 h。反应结束加入500 μL噬菌体稀释液和 20 μL氯仿, 混匀离心, 上层液即为 cDNA 原始文库, 4℃保存。取1 μL原库液做梯度稀释, 与200 μL的 XL1Blue MRF′菌株混合, 铺板, 计数蓝白色斑, 测定文库滴度及重组率。
1.2.3 cDNA 文库的扩增及质量鉴定 按每个150 mm平板生长5×104个克隆数计算, 取适量原始文库液与 XL1Blue MRF′菌株混合, 铺板。37℃孵育, 噬斑长至约1～ 2 mm, 给每个平板内加入10 mL SM 液, 4℃过夜。再放置摇床缓慢摇动1 h, 以洗脱噬菌体。收集洗脱液, 加入终浓度为50 mL/L的氯仿, 混匀, 离心取上清, 即为cDNA扩增文库。加入终浓度为3 mL/L的氯仿和70 mL/L的二甲基亚砜（DMSO）, -80℃保存。取1 μL扩增文库按梯度稀释, 铺板, 测定扩增文库滴度。同时, 随机挑取8个白色噬菌斑, 分别置于 20 μL SM 液中4℃过夜。各吸取1 μL 进行PCR反应, 以扩增插入片段。在50 μL反应体系中加入灭菌去离子水37 μL, 10×Advantage2PCRbuffer 5 μL, dNTP mix 2.0 μL, T3、 T7 引物各2 μL, Taq DNA 聚合酶1 μL。PCR反应参数: 94℃预变性1 min, 94℃ 30 s, 51 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 下一页 |
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