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人大肠癌抗原基因 cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定 |
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| 人大肠癌抗原基因 cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定 |
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重组cDNA片段的序列完整性两个方面。文库的代表性可用库容量来衡量。根据以往文献报道用抗体或血清筛选cDNA文库, 所构建的cDNA文库至少需含106以上的重组子, 重组率>90%。我们选取2株人大肠癌细胞建库, 有着相对单一的转录本库, 比新鲜肿瘤标本更具有代表性。构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库原始文库容量为2.3×109 pfu/L, 重组率约为97%, 完全达到这一标准。
本研究选用的 Stratagene公司试剂盒在合成cDNA第1链时, 所用的反转录酶StrataScript RT是由鼠源反转录酶(MMLVRT)经基因工程改造而来, 无RNaseH活性。它较未改造的酶在合成cDNA第1链时产量更高, 全长cDNA的比例也显著增加。在 cDNA第 2链合成的过程中采用的是置换合成法, 利用RNaseH在杂交链的mRNA链上造成缺口, 从而产生一系列RNA引物, 使之成为合成第2链的引物, 在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第 2链。这一做法的优点是可以使第1链 的反应产物不须进一步处理或纯化就可直接用于第2链的合成。而且不需要使用 核酸酶切割双链S1 cDNA的单链发卡环。另外也避免了在 PCR扩增过程中因扩增效率的不同所带来的 mRNA原始丰度的变化, 这对于一些较低拷贝数基因的克隆具有优势, 也是我们选择该方法的主要原因。本研究所选用的噬菌体 ZAP Express 载体, 是一个插入型载体, 既可在真核细胞表达, 又可在原核细胞表达; 在其质粒序列内有一多克隆位点, 进入宿主菌后其质粒部分可从载体上切下, 形成质粒载体。这个质粒载体多克隆位点两侧有T7和T3启动子, 有利于DNA序列分析, RNA 序列分析和 RNA 探针合成。该载体携带着存在于编码β半乳糖苷α互补片段的lacZ基因区域内的多克隆位点, 长至10 kb的 cDNA 都可以插入 lacZ 启动子下游的多克隆位点内。目的基因可定向插入位于载体多克隆位点内的EcoRⅠ和 XhoⅠ内切酶位点之间。
重组子插入片段的大小也是评价文库质量的重要标准。插入片段的大小与条件有关, 片段太短则文库质量不高。另外, lacZ 基因突变也可产生非重组的白色噬上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] 下一页 |
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